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在自然界中糖類物質(zhì)無處不在，幾乎參與了多細(xì)胞生物的全部生命過程。但是由于糖類化合物結(jié)構(gòu)固有的復(fù)雜性，想要獲得結(jié)構(gòu)明確均一的聚糖類化合物，合成難度大，往往需要具有高度專業(yè)技能的人員通過手工合成來完成，耗時費力，這嚴(yán)重制約著糖科學(xué)的發(fā)展；而對于分子尺寸更大、結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜的多糖類化合物的合成，更是一項極具挑戰(zhàn)性的工作。聚糖的高效獲取問題已成為制約糖科學(xué)發(fā)展的重要瓶頸。

糖 | Pixabay

多肽和DNA合成儀的研制成功，帶來了多肽/蛋白質(zhì)和寡核苷酸/核酸獲取途徑的革命，極大地推動了相關(guān)學(xué)科的發(fā)展。糖科學(xué)家也希望聚糖的合成能夠像多肽和寡核苷酸那樣在自動合成儀上實現(xiàn)。近些年來，雖然聚糖固相自動合成和酶法自動合成取得了一定的進(jìn)展，但聚糖固相自動合成往往需要過量的糖模塊和試劑，通常是通過單糖逐個累加的方式使糖鏈延伸（加法式合成），造成效率低下，而且合成規(guī)模較小、無法直接監(jiān)測反應(yīng)。酶法自動合成雖然能夠獲得一些天然的生物活性寡糖，但酶的來源有限、底物適應(yīng)范圍窄，無法滿足各種類型的寡糖合成需要；而且酶法往往需要核苷活化的糖，價格比較昂貴；其糖鏈的延伸也是通過單糖逐個累加的方式而實現(xiàn)（即加法式合成）。因此，糖自動合成技術(shù)的發(fā)展還處于初級階段。

(資料圖)

論文截圖

他們基于“預(yù)活化”一釜多組分寡糖合成原理，自主研發(fā)了全球首臺新型雙模式液相糖自動合成儀，并利用該合成儀自動合成了各種具有重要生物活性的復(fù)雜寡糖和多糖；發(fā)展了“自動乘法合成”策略，將合成的多糖尺寸提高到驚人的1080-mer，從而將聚糖合成水平提升到了一個新的高度，遠(yuǎn)超核酸（到200-mer）和蛋白質(zhì)（到472-mer）的合成水平。

葉新山團(tuán)隊長期致力于新的糖化學(xué)合成的方法和策略的發(fā)展。2004年，他與黃雪飛教授首次明確提出“糖基供體預(yù)活化”的新概念，提出了糖基化反應(yīng)的一種新方式，在此基礎(chǔ)上發(fā)展了基于“糖基供體預(yù)活化”的一釜寡糖合成新策略（Angew. Chem. Int. Ed., 2004, 43, 5221）。該策略的優(yōu)點是只使用帶有常見保護(hù)基的糖模塊，不需要對反應(yīng)中間產(chǎn)物進(jìn)行分離，省去了中間體分離純化的步驟，從而使合成效率提高。目前該策略已經(jīng)被應(yīng)用于各種復(fù)雜聚糖的合成，特別是該團(tuán)隊在2017年運用這個策略首次合成了均一結(jié)構(gòu)的由92個單糖單元所組成的阿拉伯半乳聚糖（Arabinogalactan），開創(chuàng)了多糖合成領(lǐng)域的先河（Nat. Commun., 2017, 8, 14851）。該團(tuán)隊還發(fā)展了光介導(dǎo)的“預(yù)活化”一釜糖基化反應(yīng)，展示了其綠色、高效和可控性強(qiáng)的特點（Org. Chem. Front., 2016, 3, 737）?；谝陨涎芯炕A(chǔ)，該團(tuán)隊著手進(jìn)行糖合成儀的研制工作。

圖1 液相糖合成儀

合成儀的研制包括硬件和軟件兩個方面。

硬件主要包括三部分：自動合成系統(tǒng)（包含自動進(jìn)樣系統(tǒng)和合成輔助系統(tǒng)），在線監(jiān)測系統(tǒng)和可編程邏輯控制系統(tǒng)。他們首先設(shè)計研發(fā)了新型可溫控反應(yīng)器，既能夠滿足光驅(qū)動的反應(yīng)，也能滿足普通的各種反應(yīng)類型，適用溫度范圍在-80 ℃-100 ℃之間；緊接著設(shè)計研發(fā)密閉、雙重控制的準(zhǔn)確自動進(jìn)樣系統(tǒng)，進(jìn)樣系統(tǒng)在惰性氣體保護(hù)下，密閉且無交叉污染的風(fēng)險，配合相應(yīng)的控制方案可適用于各種自動化合成；隨后設(shè)計研發(fā)接近實時的在線監(jiān)測系統(tǒng)，可以滿足連續(xù)多次無交叉自動取樣、進(jìn)樣、分析、對比判斷，充分利用液相色譜的分析能力滿足自動合成的直接監(jiān)測需要；最后通過可編程邏輯控制系統(tǒng)耦合自動合成系統(tǒng)和在線監(jiān)測系統(tǒng)，成功設(shè)計了新型雙模式液相糖自動合成儀的整機(jī)框架，實現(xiàn)了第一代原型機(jī)的順利組裝（圖1）。

軟件方面，可編程邏輯控制系統(tǒng)受上位機(jī)控制，基于Labview語言程序設(shè)計研發(fā)了實用的特色上位機(jī)軟件控制系統(tǒng)（Ye Glycosoft），完成對合成儀的整機(jī)控制和調(diào)試，實現(xiàn)了合成儀的穩(wěn)定運行。

在合成儀原型機(jī)成功研發(fā)的基礎(chǔ)上，該團(tuán)隊首先用一個四糖的合成來驗證儀器的可靠性，分別通過普通活化模式和光介導(dǎo)活化模式對四糖進(jìn)行自動化合成，驗證了合成儀的可行性。為了進(jìn)一步驗證糖合成儀的功能，該團(tuán)隊利用所研制的合成儀，進(jìn)行了如下三個方面的工作：

圖2 普通活化模式下生物活性寡糖的自動合成

1. 用合成儀合成了一個含有多種重要生物活性寡糖的化合物庫。

他們首先在普通活化模式下（一般以Ph2SO/Tf2O或者p-TolSCl/AgOTf作為活化體系），通過一釜五組分反應(yīng)（1*5 = 5）完成了兩種β-1,6連接的葡聚五糖的自動化合成；隨后在此基礎(chǔ)上通過一釜三組分反應(yīng)（5*3 = 15）完成了β-1,6連接的葡聚十五糖的自動化合成。

此外，通過一釜五組分反應(yīng)（1*5 = 5）完成了甘露五糖的自動合成；通過一釜四組分（1*4 = 4）和一釜五組分反應(yīng)（1*5 = 5）分別完成了β-1,4-連接的殼聚四糖和殼聚五糖的自動合成；通過[1+2+1+2]策略一釜自動合成了結(jié)構(gòu)復(fù)雜、具有重要活性的腫瘤相關(guān)糖抗原Globo H；含有高碳糖唾液酸的腫瘤相關(guān)糖抗原Fucosyl GM1 (Fuc-GM1)和cis-糖苷鍵的A血型糖抗原也都被成功構(gòu)建（圖2）。

接下來，在光介導(dǎo)模式下，以Umemoto試劑作為光活化劑，作為N-聚糖和多種腫瘤相關(guān)糖抗原核心骨架的polyLacNAc八糖通過四組分反應(yīng)(2*4 = 8)被成功構(gòu)建；緊接著作者通過一釜三組分策略完成了以LNT（Lacto-N-tetraose）和LNnT（Lacto-N-neotetraose）為核心結(jié)構(gòu)的七種重要生物活性抗原（H型抗原、B/O血型抗原和LewisX、LewisY抗原）的自動化合成（圖3），這些抗原是人乳寡糖和鞘糖脂的重要組成部分。

圖3 光介導(dǎo)活化模式下生物活性寡糖的自動合成

2. 以克級規(guī)模高效自動制備保護(hù)的磺達(dá)肝葵鈉五糖。

磺達(dá)肝葵鈉是首個也是目前唯一一個人工合成的已上市肝素類寡糖抗凝藥物，于2002年上市。雖然目前已有化學(xué)合成和化學(xué)酶法合成的報道，然而超過50步、總收率低于0.1%的化學(xué)合成使其成為最貴的肝素類藥物，限制了其應(yīng)用。該團(tuán)隊以p-TolSCl/AgOTf作為活化體系，通過[1+2+2]策略高收率地自動合成了保護(hù)的磺達(dá)肝葵鈉五糖（圖4）。這是磺達(dá)肝葵鈉五糖的首次自動化制備，其合成規(guī)模易于放大的特點對于磺達(dá)肝葵鈉制備工藝的改進(jìn)具有重要意義。

圖4 克級規(guī)模自動制備保護(hù)的磺達(dá)肝葵鈉五糖

3. 多組分自動乘法合成阿拉伯聚糖。

在前面工作基礎(chǔ)上，作者開始研究一釜更多組分?jǐn)?shù)的自動合成和大分子尺寸多糖的自動組裝。他們選擇了植物和致病菌細(xì)胞壁都普遍存在的阿拉伯聚糖作為合成目標(biāo)。以p-TolSCl/AgOTf作為活化體系，能夠以一釜十組分反應(yīng)（1*10 = 10）實現(xiàn)阿拉伯十糖的自動化合成，分離收率為47%（平均每步92%），完成了手工合成難以完成的工作。

在高收率克級規(guī)模自動制備阿拉伯六糖的基礎(chǔ)上，作者繼續(xù)通過自動乘法合成策略來制備大分子尺寸的阿拉伯聚糖。反應(yīng)過程包括重復(fù)的兩次操作：（1）自動一釜多組分反應(yīng)獲得供體中間體；（2）脫除供體中間體上的臨時保護(hù)基得到受體中間體。從單糖模塊出發(fā)，自動一釜六組分反應(yīng)得到六糖供體（1*6 = 6），脫除六糖供體上的臨時保護(hù)基（TBS）得到六糖受體；自動一釜五組分反應(yīng)得到三十糖供體（1*6*5 = 30），脫除三十糖供體的臨時保護(hù)基得到三十糖受體；自動一釜四組分反應(yīng)得到一百二十糖供體（1*6*5*4 = 120），脫除一百二十糖供體的臨時保護(hù)基得到一百二十糖受體；自動一釜三組分反應(yīng)得到三百六十糖供體（1*6*5*4*3 = 360），脫除三百六十糖供體的臨時保護(hù)基得到一個三百六十糖受體；自動一釜三組分反應(yīng)[360+360+360]，得到驚人的1080糖（分子量達(dá)到352,700 Da）。該大分子尺寸的阿拉伯聚糖通過五步乘法擴(kuò)增獲得（1*6*5*4*3*3 = 1080），是目前人工合成的最大、最長的均一結(jié)構(gòu)的多糖分子。最后，作者通過優(yōu)化條件，將保護(hù)的1080糖進(jìn)行保護(hù)基脫除（1個TBS、1080個Bz和1080個Bn，共2161個保護(hù)基），得到完全脫保護(hù)的1080糖（分子量達(dá)到142,800 Da）（圖5）。

圖5 由單糖開始自動乘法合成線性1080-mer阿拉伯聚糖

總結(jié)：該團(tuán)隊基于糖基供體“預(yù)活化”一釜寡糖合成和連續(xù)乘法合成原理，研制出一種新型雙模式的液相糖自動合成儀，它克服了現(xiàn)有的通過單糖逐個累加方式延伸糖鏈方法的缺陷。

該合成儀的實用性從三個方面得到了驗證：

在普通活化模式或者光介導(dǎo)活化模式下，成功合成了包括各種糖型和糖苷鍵、具有重要生物活性的寡糖化合物庫；

合成了保護(hù)的抗凝糖藥物磺達(dá)肝葵鈉五糖，可以實現(xiàn)克級規(guī)模的制備；

成功執(zhí)行了“一釜”十組分自動偶聯(lián)反應(yīng)得到阿拉伯十糖；進(jìn)而利用自動乘法合成策略，合成了結(jié)構(gòu)均一的阿拉伯聚糖（1080糖?。?。

這代表著人工合成均一結(jié)構(gòu)生物大分子復(fù)雜度的單體組成數(shù)目首次達(dá)到了四位數(shù)水平，在多糖合成領(lǐng)域具有重要的里程碑式意義。

該合成儀將為非專業(yè)人員提供一個組裝目標(biāo)聚糖的平臺，填補(bǔ)國內(nèi)外在液相糖合成儀研制方面的空白，將為糖科學(xué)及其在醫(yī)藥和材料領(lǐng)域的應(yīng)用提供新的有效的工具。

供稿：科學(xué)網(wǎng)

研究團(tuán)隊

通訊作者葉新山：教授，北京大學(xué)藥學(xué)院

第一作者姚文龍：博士后，北京大學(xué)藥學(xué)院